细胞传代

细胞传代

一、什么是传代？

传代即去除原培养基并将细胞从原培养体系转移到新鲜的生长培养基中，该过程可使细胞系或细胞株进一步增殖。

二、何时传代？

当细胞密度达到铺满整个瓶底有效基质时，或者当细胞浓度超出培养基的能力时，细胞生长停止或者生长速度大大减慢，此时需要将细胞进行分瓶、传代或者转移，传代后一般以较低的密度和浓度继续培养。传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。

三、传代原理

细胞传代到下一次传代的生长过程通常遵循一种标准的方式，接种后依次经历延迟期、对数及平台期。细胞应在进入平台期之前的对数期进行传代以提高接种效率并缩短延迟期。

体外培养细胞根据分型分贴壁生长型和悬浮生长型。对于贴壁细胞，因需依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在可以贴附的支持物表面上生长，繁殖，传代时需要通过蛋白酶消化使细胞从支持物表面脱离同时使细胞与细胞之间分散，再以新鲜培养基稀释并以适当浓度重新接种于新培养瓶中。悬浮细胞因生长不依赖支持物表面，呈悬浮状态生长，传代培养时可直接离心去除旧培养基再以新鲜培养基稀释，并以适当浓度重新接种于新培养瓶中。

四、传代操作

1.所需材料

• 磷酸盐缓冲液，PBS
• 胎牛血清，FBS
• 完全培养基，预热至37℃
• Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red
• 台盼蓝溶液
• 血球计数器
• 75%酒精喷壶
• 15ml无菌离心管
• 细胞培养瓶

2.传代流程

2.1 贴壁细胞传代

（1）观察细胞状态，若细胞状态良好，则继续进行细胞悬液制备；若细胞状态不好，停止操作。细胞状态观察分为肉眼观察和显微镜观察：首先从培养箱中取出细胞后，观察培养基的颜色，红色至桔红色合格，黄色培养基指示培养基中酸性代谢积累过多，细胞状态不好；其次显微镜下明场观察细胞，确认（i）细胞没有污染，（ii）细胞外观健康，没有空泡、拉丝或过多细胞碎片等现象，（iii）细胞形态特征符合细胞名称，（iv）细胞处于对数期晚期，即细胞的汇合程度在80%到刚完全汇合。

（2）生物安全柜（或超净工作台）先开紫外照射30 min。并将需要室温回温的培养基、Trypsin-EDTA (0.25%)等从冰箱或储存室中取出放置临时回温区回温。紫外关闭后，开启生物安全柜或超净工作台，正常运行10 min以使柜内气流平稳。用沾有75%酒精的擦拭纸对工作台面进行全面擦拭，包括前面玻璃屏风内侧面。将首先需用到的物品用75%酒精表面擦拭后移入工作台内，注意工作区的布局，如下图1：

图1 生物安全柜或超净工作台台内基本布局
（3）按要求配制好所需用到的试剂，如血清一般保存于－20℃需提前将血清从－20℃转入4℃，配置完全培养基时确保血清已完全解冻。

（4）将细胞培养器皿经沾有75%酒精擦拭纸表面擦拭消毒后，移入工作台内。移除细胞原有上清液，加入室温状态的 PBS 以使充分浸润，手动摇匀以清洗细胞和残留培养基，然后移除上清液。

（5）加入Trypsin-EDTA (0.25%)，覆盖细胞层底面，放至37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中消化，计时器计时，当肉眼观察细胞由单层连接成片的半透明转为出现细小空闲的点状透明，显微镜下观察，大部分已皱缩呈球形，小部分细胞维持原状，此时可将培养器皿经表面消毒后移入工作台内，加入3倍Trypsin-EDTA (0.25%)体积室温状态的完全培养基混匀终止消化，同时部分细胞也会从瓶壁上滑下。

（6）根据细胞悬液体积取适宜大小离心管，标记好后，电动移液器或巴氏吸管吸取细胞悬液于离心管中，然后放入普通离心机中， 室温下调至1200 rpm(约300 g)离心3 min-5 min。。

（7）离心结束后，取出离心管，此时肉眼可观察管底有乳白色细胞沉淀，用75%酒精表面消毒后将其移至工作台内， 吸弃上清液，手指弹拨离心管管壁以分散细胞，再加入完全培养基，混匀细胞，然后进行细胞计数 。

（8）根据培养器皿的不同底面积种入相应数量的细胞， 并用防酒精记号笔在培养器皿外表面（培养板板盖或培养瓶侧面）做好标记，标记信息至少包括：细胞名称、代次、每孔/板/皿细胞数、操作人、日期。
（9）放回37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中静置培养。

2.2 悬浮细胞传代

（1）观察细胞状态，若细胞状态良好，则继续进行细胞悬液制备；若细胞状态不好，停止操作。细胞状态观察分为肉眼观察和显微镜观察：首先从培养箱中取出细胞后，观察培养基的颜色，红色至桔红色合格，黄色培养基指示培养基中酸性代谢积累过多，细胞状态不好；其次显微镜下明场观察细胞，确认（i）细胞没有污染，（ii）细胞外观健康，没有空泡或过多细胞碎片等现象，（iii）细胞形态特征符合细胞名称。

（2）生物安全柜（或超净工作台）先开紫外照射30 min。并将需要室温回温的培养基及其他试剂从冰箱或储存室中取出放置临时回温区回温。紫外关闭后，开启生物安全柜或超净工作台，正常运行10 min以使柜内气流平稳。用沾有75%酒精的擦拭纸对工作台面进行全面擦拭，包括前面玻璃屏风内侧面。将首先需用到的物品用75%酒精表面擦拭后移入工作台内。

（3）按要求配制好所需用到的试剂，具体细胞的培养基配方见表1。如血清一般保存于－20℃需提前将血清从－20℃转入4℃，配置完全培养基时确保血清已完全解冻。

（4）将细胞培养器皿经沾有75%酒精擦拭纸表面擦拭消毒后，移入工作台内。根据细胞培养液总体积，取相应大小的离心管，细胞悬液转移至上述离心管中， 1200 rpm(约300 g)离心3 min-5 min。。

（5）取出离心管， 用75%酒精消毒离心管表面后将其移至工作台内， 吸弃上清液（注意，为不吸走细胞沉淀，电动移液器或巴氏吸管吸头不能接触到细胞沉淀），手指弹拨离心管管壁以分散细胞，再加入完全培养基混匀细胞，然后进行细胞计数。

（6）根据培养器皿的不同种入相应数量的细胞。种入细胞后用防酒精记号笔在培养器皿外表面（培养板板盖或培养瓶侧面）做好标记，标记信息至少包括：细胞名称、代次、每孔/板/皿细胞数、操作人、日期。

（7）放回37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中静置培养。

五、细胞传代注意事项

• 1.不要同时打开一种以上细胞的培养瓶或培养基。
• 2.生长迅速的细胞系，如HeLa，单独操作并在其他细胞后进行。
• 3.不同的细胞系不要使用同一吸管。
• 4.不同的细胞系不要使用同一瓶培养基、同一瓶胰蛋白酶或者其他物质。一种细胞使用一套培养基和试剂。
• 5.进入包含细胞的培养瓶后的吸管不要放回培养基、胰蛋白酶或其他物质中。
• 6.向培养瓶中首先加入培养基和其他物质，最后加入细胞。
• 7.常规培养中，不要使用不塞棉花的吸管和移液管。
• 8.经常检查培养物的特性，注意形态、生长速率和其他形态学特点的突然改变。

• 六、贴壁昆虫细胞传代的注意事项
• 1.昆虫细胞应在对数期传代。但是，如果培养的是强贴壁性昆虫细胞，则应在细胞达到汇合状态或者刚刚开始从培养瓶底部脱离时进行传代，因为此时细胞容易脱离。
• 2.细胞密度低于汇合状态的20%时，细胞生长会受到抑制。健康状态最好的细胞是对数期收获的细胞。
• 3.培养昆虫细胞时建议不要进行二氧化碳交换。
• 4.昆虫细胞应于27℃、非湿化环境中培养。在避光条件下可将细胞放在操作台上或者放入抽屉中于室温下培养。但是，建议使用温度控制在27℃的环境。
• 5.使用昆虫细胞专用的培养基。
• 6.在无血清培养条件下，昆虫细胞与基质贴附极为牢固，需要花费较大力气才能使其脱落。要使细胞脱落，可以采用拍掌的动作快速振摇一下培养瓶。为了避免污染，进行此操作前必须盖紧盖子。

参考资料：

《细胞培养基本知识手册-GIBCO》

《动物细胞培养基本技术和特殊应用指南 第12章 传代培养和细胞系》