细胞培养常见污染

细胞培养常见污染

一、污染和生物安全 

   细胞培养物污染往往是细胞培养实验室最常遇到的问题，有时会带来十分严重的后果。细胞培养污染物主要分为两类，一类是化学污染物，例如：培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂，另一类是生物污染物，例如：细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。尽管无法彻底消除污染，但是可以通过充分了解污染源以及采用良好的无菌技术，降低污染发生的频率和严重程度。 

二、检查是否有微生物污染 

   当大多数细菌污染发生时，通常会在几天内发生，并且通常是肉眼可见的。培养基的明显变化，如浊度、悬浮液中可见颗粒的存在，以及 pH值的快速下降（黄色，表示酸度）都是细菌污染的指标。生长非常缓慢的嗜好性细菌种类可能难以检测。 真菌污染物可能会也可能不会引起培养基pH值的变化，可以通过检查悬浮液中是否存在丝状结构来与细菌区分。酵母细胞比细菌大，但可能不会明显改变培养基的pH值，并且会出现独立的圆形或卵圆形颗粒。可用于检测细菌和真菌污染的微生物培养基包括琼脂、胰蛋白酶大豆肉汤、BHI肉汤、Sabouraud肉汤、YM肉汤和含有2%酵母提取物的营养肉汤。然而，有些微生物污染并不明显。例如，使用抗生素可以抑制细菌生长，从而掩盖污染。一些病毒感染不会改变细胞的形态，而检测支原体污染需要特定的检测方法。

三、污染来源

• 溶液、玻璃器皿和移液管的灭菌程序出错
• 室内空气中的气流和粒子（灰尘和孢子）
• 培养箱和电冰箱维护差
• 有问题的生物安全柜
• 引入已经被污染的细胞系或活体组织
• 无菌操作上的失误

四、微生物污染分类

1.细菌污染

  细菌污染速度快，易被发现。多数情况下细胞培养液短时间内变黄，培养基1～2d就会变浑浊，pH值降低，倒置显微镜下观察，可见胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从壁上脱落，培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，呈细沙状，污染较轻时可见小菌体在细胞间运动。污染的培养物呈云雾状（浑浊），有时表面会覆盖一层薄膜；低倍镜下可见细胞间移动的微小颗粒；高倍镜下可见细菌呈球状、杆状、螺旋状。建议灭菌后丢弃，不尝试去除污染，除非细胞至关重要。

图1 贴壁生长的293细胞被大肠杆菌污染

2.霉菌污染

  霉菌污染初期，培养物pH维持稳定，污染加重后pH会迅速升高，培养物浑浊。显微镜下，菌丝体呈细束状纤维，多时呈密集的孢子团块。建议灭菌后丢弃，不尝试去除污染，除非细胞至关重要。

图2 成纤维细胞霉菌污染

3.酵母污染

  与细菌污染类似，培养物浑浊，污染严重时pH值会上升。显微镜下,污染的酵母呈卵圆形或球形颗粒，复制时会芽生出较小的颗粒。建议丢弃污染的培养物，不尝试去除污染，除非细胞至关重要。

图3 293细胞酵母污染

4.支原体污染

  支原体是一种没有细胞壁的简单细菌，被认为是能够自我复制的最小的生物。由于体积极小（一般小于1微米），支原体的检测十分困难，除非其达到极高的密度，导致细胞培养物变质，在此之前往往没有明显的感染征象。有些生长缓慢的支原体可能会在培养物中持续存在，而不会导致细胞死亡，但是这些支原体会改变培养体系中宿主细胞的行为和代谢。慢性支原体感染的可能表现包括：细胞增殖速度降低、饱和密度下降以及悬浮培养物凝集。在原代培养和早代次细胞的感染通常导致培养物的迅速降解及死亡，但连续细胞对感染有一定的耐受，常常不易被察觉。

防止：建立一个支原体检测体系绝对必要，以确保：①增殖的细胞没有污染；②任何新引入实验室的物质（组织、细胞系、生物制品）不会带来污染。

检测：微生物培养、DNA荧光染色（Hoechst33258）、PCR等。

图4 细胞支原体污染状态图

5.交叉污染

  细胞交叉污染，一般来自细胞建株和细胞传代过程中两种或两种以上细胞之间的混合污染细胞系的交叉污染是实验室中严重的问题。

防止：严格的操作程序必须落实到位（不要在细胞系间或操作者间共用培养基或其他试剂），经常检查细胞的特征

检测：观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等，STR图谱。

6.病毒污染

病毒是一种微观感染性物质，可来源于培养物本身、引入的细胞系、天然产品如血清、传代的酶等，目前无确定的方法可排除病毒污染。由于大多数病毒对宿主有非常严格的要求，因此一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响。但是，使用病毒感染的细胞培养物时却会对实验室工作人员造成严重的健康威胁，特别是当实验室培养的是人或灵长类动物细胞时。

检测：抗体的免疫染色、ELISA分析、PCR法、动物接种

五、预防污染

培养中的细胞污染可能来自很多方面，包括其他细胞系、试剂、移液器和培养容器等用品、组织培养罩和培养箱等设备以及实验室人员。 虽然污染的可能性是恒定的，但通过适当的预防措施可以减少或消除风险：只使用已知质量和无菌的试剂，隔离新的细胞系，直到它们被测试为无污染，对所有设备进行日常维护和清洁，并适当培训细胞培养人员。

参考资料：

1.《细胞培养基本知识手册-GIBCO》

2.Animal Cell Culture Guide-ATCC