人类胚胎干细胞在体外三维培养系统中分化为肝细胞的方法
人类胚胎干细胞在体外三维培养系统中分化为肝细胞的方法
肝细胞移植已被证明是一种治疗人类代谢性肝病的可行方法。然而，原代培养的肝细胞在体外不能充分复制以产生移植所需的细胞数量，或者不能在体外保持其分化的特性。
人类胚胎干细胞（hESCs）作为细胞替代疗法的细胞来源和人类早期发育的模型具有巨大的潜力。这些细胞可以在体外以未分化的状态广泛增殖，并保持正常的核型。他们还具有分化成多种细胞系(即外胚层、中胚层和内胚层)的潜力。人类ESCs可以为细胞移植提供肝细胞来源，为体外肝脏分化研究提供有效模型。 最近使用三维（3D）支架系统进行的组织工程研究已经证明了它们在体外培养EScs的有效性。3D培养条件可能更接近于模仿体内环境。有报告表明，在3D培养系统中出现明显的细胞行为，而这在标准单层培养或2D培养中是观察不到的。本文介绍一种利用胶原蛋白基质诱导人类胚胎干细胞在体外三维培养系统中分化为干细胞的方法。
方法
A.培养人类胚胎干细胞
人类ESCs在hESC培养基中（80% Knockout Dulbecco改良Eagle培养基（KO-DMEM；Gibco/BRL）培养，补充20%符合ES标准的胎牛血清（ES-FCS Gibco/BRL）、2 mM谷氨酰胺（Gibco）、 0.1 mMβ-巯基乙醇（Sigma）、1 %非必需氨基酸储备（Gibco/BRL）， 5 mg/ml 胰岛素，5 μg/ml 转铁蛋白， 5 μg/ml硒 （ITS，Gibco/BRL） ， 100 U/ml青霉素和100 μg/ml 链霉素（Gibco/BRL）。细胞在5％
和95％湿度下生长。大约每七天将细胞传代在经过丝裂霉素新处理的MEF上。
B.肝脏分化的体外诱导
1.将hESCs的集落用机械分离（300-500个细胞）， 并在hESC培养基中以 “悬滴”的形式（20 μl）培养2天以产生胚胎状体（embryonic bodies，EBs）。
2.将形成的EBs转移到含有相同培养基的100 mm培养皿中再悬浮培养3天。
3.采用胶原3D细胞培养试剂盒（赤萌医疗），按照说明书调配胶原混合液，将其转移到24孔培养板中，高度2mm，置于37C培养箱中孵育1h使其形成胶原凝胶。
4.使用立体显微镜，在显微镜下每个胶原蛋白支架上做一个约0.1 mm的切口，将5个EB植入切口。
5.加入生长因子
（1）在分化后的不同天数向培养基中加入几种生长因子。在第9天至第12天加入酸性成纤维细胞生长因子（aFGF，R&D Systems）（100 ng/ml）以诱导肝脏分化。
（2）从第12天到第20天加入肝细胞生长因子（HGF，R&D Systems）(20 ng/ml)作为中期因子。
（3）从第 15天起至第20天，加入肿瘤抑制因子Oncostatin M（OSM，R&D Systems）（10 ng/ml）、地塞米松（Dex，Sigma）（10-7M）、5 mg/ml胰岛素、5 mg/ml转铁蛋白和5 μg/ml硒（ITS，Gibco/BRL）作为后期因素。如此细胞被培养至第28天。
将悬浮培养形成的胚胎体植入含有胶原支架的3D系统用外源生长因子刺激。通过相差显微镜分析细胞分化早期(图1C)和晚期(图1 D)阶段的细胞形态。3D培养系统中的细胞从聚合体中迁移出来，形成线状和多层结构（图1D）。
图1. HESC衍生的肝细胞样细胞的形态特征
参考文献
Int J Dev Biol. 2006;50(7):645-52.
