基于胶原蛋白的培养胃肠道衍生类器官的方法

基于胶原蛋白的培养胃肠道衍生类器官的方法

  类器官是一种细胞结构，由体外的自组织干细胞衍生而来。它包括细胞群和三维(3D)结构，并具有对应器官的器官特异性功能。3D培养方法在胃肠道中分离出的上皮干细胞中取得的进展，使上皮器官的生成成为可能。这些类器官在体内重现生理机能，包含源自上皮干细胞的所有组织特异性细胞类型及其增殖特性。这些模型可为研究病理生理学、筛选药物功效和测试药物毒性提供一个体外平台。类器官也可以用于受损上皮组织的治疗，因为在动物模型中可以治愈肠道上皮组织的炎症性疾病。

  由细胞外基质 (ECM) 蛋白（如层粘连蛋白和胶原蛋白）诱导的信号传导对于干细胞增殖、分化和执行适当的功能至关重要。因此，ECM 必须支持上皮干细胞增殖并维持其作为类器官的形式。目前，用于制造大多数类器官的细胞外基质是基质胶（Matrigel）。因为原始肠上皮类器官的制备方法是使用基质胶（Matrigel）作为 3D 支架。基质胶（Matrigel）是一种由小鼠 EHS 肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物，含有层粘连蛋白、内联蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖和各种生长因子，可诱导适合类器官形成的细胞外基质信号传导。然而，有多种证据表明，含有基质胶（Matrigel）的材料在注射到体内时可能会促进血管生成。基质胶（Matrigel）中的成分定义不明确，因此很难预测其对人体的影响，而且批次间的差异非常严重，以至于难以计划可重复的研究。由于这些风险，使用基质胶（Matrigel）的材料无法获得食品和药物管理局 (FDA) 的批准，并且很难获得其在临床试验中使用的批准。

  胶原蛋白是生物体细胞外基质组成蛋白的通用成分，具有多种作用如支持体内的细胞分裂、迁移和分化。胶原蛋白已被用于二维、三维、多种细胞和器官的培养，以及在医学上的应用，包括治疗细胞的扩展培养、人造皮肤和化妆品。通过用基于胶原蛋白的基质代替基质胶（Matrigel）进行类器官培养，有可能培养出适合临床应用的类器官。本文介绍一种基于胶原蛋白基质培养源自大肠、小肠和胃的类器官的方法。

方法：

A.用于类器官培养的胶原基质的制备

采用高浓度牛I型胶原蛋白（胶原3D细胞培养试剂盒，赤萌医疗），用5×F12替换5×DMEM培养基后，按照说明书调配胶原混合液（注意，操作时保持在冰上，以防胶原蛋白形成凝胶）。该混合物可按照需要，采用Ham's F-12进一步稀释至实验用胶原蛋白浓度（2-4 mg/mL）。

B.小鼠结肠类器官的分离和培养

1.从 5 至 7 周大的 C57BL/6 小鼠获得小鼠结肠隐窝。

2.用螯合缓冲液（DPBS 中的 2 mM EDTA）冲洗结肠 30 分钟。

3.用解离缓冲液（DPBS 中的 1% D-山梨糖醇和 1% 蔗糖）剧烈颠倒几分钟来分离隐窝。

4.分离的隐窝通过 70 μ m 细胞过滤器过滤。

5.并以 1:1 的比例加入制备好的胶原基质，然后接种在多孔板中。

6.基质聚合后，加入小鼠结肠类器官生长培养基，并在 37°C 下用 5% CO2 加湿培养箱培养。

7.每2天更换一次培养基。

8.基础生长培养基补充有10% R-Spondin 1 conditioned medium、50 ng/mLmEGF、100 ng/mL mNoggin、50% Wnt-3A conditioned medium、500 nM A83-01、10 μM Y-27632 和 2.5 μM CHIR99021。传代培养2 天后除去CHIR99021。

C.小鼠小肠类器官的分离培养

1.将小鼠小肠阴窝组织从近端到远端纵向切成5 mm的小块，再横切打开。

2.用Gentle Cell Dissociation Reagent分离小肠隐窝。

3.分离的隐窝通过细胞过滤器过滤。

4.与基质胶或基于胶原的基质以 1:1 的比例混合并接种在多孔板中。

5.基质聚合后，加入小鼠小肠类器官生长培养基。

6.小鼠小肠类器官生长培养基的组成如下：基础生长培养基补充有 10% R-Spondin 1 conditioned medium、mEGF、mNoggin、A83-01、Y-27632 和 CHIR99021。

D.小鼠胃类器官的分离培养

1.从幽门窦到胃底获得小鼠胃组织。

2.将组织打开并在冰冷的 DPBS 中洗涤数次。

3.将组织放入5 mL冰冷的螯合缓冲液（DPBS 中的 5 mM EDTA）中，并在室温下在定轨振荡器上孵育 2 小时。

4.孵育后，加入 5 ml 解离缓冲液并用手轻轻倒置 1-2 分钟。

5.通过细胞过滤器过滤后，以1:1的比例接种基质胶或基于胶原的基质并接种在多孔板中。

6.基质聚合后，加入小鼠胃类器官生长培养基。

7.小鼠胃类器官生长培养基的组成如下：基础生长培养基补充有 10% R-Spondin 1 conditioned medium、mEGF、mNoggin、50% Wnt-3A conditioned medium、500 nM A83-01、10 μ M Y- 27632，10 nM的[Leu15] -Gastrin 1，200 ng/mL FGF10和2.5 μM CHIR99021。

图1在基质胶（Matrigel）和基于胶原的基质培养系统中维护小鼠结肠类器官。(a) 在第 3 代基质胶和胶原蛋白中小鼠结肠类器官的生长模式。标尺为 50 μm。

图2在基质胶（Matrigel）和基于胶原的基质培养系统中维护小鼠结肠类器官。

参考文献 

Stem Cells Int  . 2019 Jun 13;2019:8472712.