利用纤维状胶原蛋白涂层从人类多能干细胞分化类似间充质干细胞（MSC）的细胞
利用纤维状胶原蛋白涂层从人类多能干细胞分化类似间充质干细胞（MSC）的细胞
人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（hiPSCs） 是有吸引力的细胞治疗干细胞来源。多能成体干细胞，如人类骨髓衍生的间充质干细胞(MSCs)显示出治疗大型和严重骨骼缺陷的前景，包括修复受损的软骨，但它们的数量有限，并在扩增过程中迅速失去其分化潜力。在移植前将hESCs和hiPSCs分化为多能祖细胞或明显分化的细胞，是安全和有效使用多能干细胞的最有希望的方法之一。然而，hESCs和hiPSCs稳定和有效地分化为临床相关的祖细胞或成熟细胞类型仍然是一个重大挑战。
一些研究小组已经探索了从hESCs中获得MSC或MSC样细胞的策略，包括与所需的细胞类型共同培养；补充含有生长因子鸡尾酒的培养基培养的方法；不受控制的胚胎体自发分化，然后通过流式细胞仪分选获得所需的表型，也被用 来获得间充质干细胞。在其他研究中，间充质干细胞来自自发分化的胚胎状体（EBs）或简单培养基中的聚集体，由于要去除EBs，所以需要长时间的连续传代。所有这些方法得到的细胞的间充质干细胞表面标记呈阳性，并能在体外分化成两到三个 间充质谱系，即成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。虽然这些方法最后的细胞分化效果都很好，但也有内在的局限性，包括复杂的细胞分选、大量的培养时间和相关的劳动成本，最重要的是效率和产量低。本文介绍一种利用I型胶原，快速有效低成本地从hESCs和hiPSCs中获得MSCs或MSC样细胞的方法。
方法：
A.纤维状I型胶原蛋白涂层的制备
1.按照以下比例将溶液混合， 1×PBS：0.1M NAOH：10×PBS：1mg/mL 胶原蛋白原液=17：1:1:8。胶原蛋白原液最后加 入，以减少不溶性聚集体的形成。
2.在12孔非组织培养板中，每孔加入一毫升的稀释溶液。在37uC和5%CO的湿润空气中孵育12小时。
3.从板中吸出凝胶状上清液，用PBS冲洗涂层表面两次。
4.在每个孔中加入1毫升PBS以覆盖涂层。将涂层板密封并储存在4uC以备日后使用。
B. hESCs和iPSCs的培养
hESCs 和人类诱导多能干细胞系iPSCs按照一般要求进行培养。
C.纤维状胶原涂层上的间充质干细胞的衍生
1.分离前，hESCs和iPSCs，用10 uM ROCK抑制剂Y-27632在维持培养基中处理1小时。
2.去除维持培养基后每孔加入1毫升Accutase H在37C培养箱中培养10分钟，细胞形成的集落解离成单细胞。
3.细胞离心后，重新悬浮在补充有10 uM ROCK 抑制剂Y-27632的维持培养基中。
4.在维持培养基中，单细胞以15,000/cm2的密度被播种到胶原蛋白涂层上。24小时后，在维持培养基中补充等体积的衍生培养基，其中包含基础α-MEM、10% FBS、100 U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素、100 nM地塞米松和50 uM L-抗坏血酸磷酸镁。
5.再培养两天后，用衍生培养基补充培养基，此后每3-4 天更换一次。
6.10天后，收获细胞并将其标记为P0代类MSC样细胞。
hESC培养物10天后（P0）在胶原蛋白涂层上获得的细胞的典型成纤维细胞样形态。细胞位于独立的集落中，板块的一些区域仍然开放。
参考文献
PLoS ONE 7(3): e33225.
