胶原定量检测(II)

  

   胶原定量检测(II)

紫外分光光度法因蛋白质分子中芳香族氨基酸等残基中含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的特性,最大吸收峰在280 nm 处。因蛋白质在最大吸收峰处的吸光度与其浓度成正比,可根据蛋白质溶液的吸光度,定量测定测得样品中蛋白质的含量。紫外吸收法操作简便迅速,常用于生物化学研究和生物样品的分析测定,同样可以用于胶原和胶原蛋白的测定。但是,胶原中色氨酸和酪氨酸含量较一般蛋白质少,只是苯丙氨酸含量与大多数蛋白质差不多,因此,紫外吸收法用于测定胶原时,同样浓度的胶原在280nm处的吸光度要小于其他蛋白质。现在虽然有时也用紫外吸收法测定胶原,但较多情况下是用其改进的方法,即将胶原样品先与含有芳香环的试剂反应,制备成其衍生物,再进行紫外测定。

考马斯亮蓝染色法是利用考马斯亮蓝染料与蛋白质结合后呈蓝青色,蛋白质与色素结合物在 595 nm 下的吸光度与蛋白质含量成正比。该法测定快速、简便、稳定性好、灵敏度高、重现性好、干扰物质较少。 但该方法的线性关系会随着在蛋白质含量的增加而越来越偏差,同时蛋白质的芳香族氨基酸和碱性氨基酸残基含量会影响考马斯亮蓝染料与蛋白质结合状况,因而在不同蛋白质含量的测定中有偏差。此外,该反应会受强碱性缓冲液、 十二烷基硫酸钠(SDS)、去污剂、TritonX-100 等物质的干扰 。

天狼猩红法利用天狼猩红与胶原特异性结合,经NaOH溶液洗脱、离心后获得红色复合物,在特定波长540nm条件下通过测定吸光度,确定胶原含量。此法的灵敏度为1µg,最适检测范围为3~100µg。常见的胃蛋白酶、胰蛋白酶、人IgG、人血浆铜蓝蛋白、溶菌酶等不与天狼猩红结合,常用的试剂NaCl、KCl、MgCl2、KHPO4、Tris、Triton-100等对测定无影响。

羟脯氨酸测定法是由于羟脯氨酸是胶原的特征氨基酸,测定胶原水解后羟脯氨酸的含量是对胶原进行定量的最准确的方法。有关羟脯氨酸的测定方法大都是对氧化脱羧生成的吡咯与二甲氨基苯甲醛显色,然后测定其吸光度。测定羟脯氨酸的方法很多,包括分光光度法、氨基酸分析仪法、HPLC法、电泳法、离子色谱法、液质法等。其中分光光度法应用最广,其他方法应用较少。

 

参考资料

[1] 蒋挺大.胶原与胶原蛋自.第1版.北京:化学二业出版社,2006.

[2] 李国英,刘文涛.胶原化学.北京:轻工业出版社,2013.

[3] 汤克勇.胶原物理与化学.北京:科学出版社,2012.

  

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