胶原定量检测（I）

  

   

胶原定量检测（I）

胶原或胶原蛋白的定量分析有多种方法，对于已知是胶原或胶原蛋白的样品，包括凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝染色法、天狼猩红法、羟脯氨酸测定法。

凯氏定氮法依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后浓氢氧化钠碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量算出含氮量，再将含氮量乘以蛋白质换算系数6.25计算出蛋白质含量，胶原蛋白的换算系数应该用5.54。目前凯氏定氮法是世界上测定蛋白质样品中总有机氮的最准确和最简单的方法之一，广泛应用于各类蛋白质的测定，可分为常量和微量凯氏定氮法两种。但存在灵敏度低、操作复杂、耗时过长（8-10h）、试剂消耗量过大等缺点。

双缩脲法依据蛋白质分子中含有两个以上的肽键，它会在碱性条件下与 CuSO₄ 溶液发生双缩脲反应，反应过程中肽键中的氮原子和 Cu²⁺结合形成紫红色的络合产物。在一定范围内，络合产物颜色的深浅与蛋白质的含量符合朗伯-比尔定律。双缩脲法操作简便、迅速，但缺点是准确度和灵敏度较低，并受 C₄H₁₁NO₃、EDTA和一些氨基酸等干扰。测定范围也为仅为1 mg~20 mg蛋白质。

Folin-酚法（Lowry法）：Lowry 法与双缩脲比色法的原理很类似。蛋白质中的肽键和 Cu²⁺发生双缩脲反应，生成蛋白质-铜络合物。同时，酚试剂被蛋白质-铜络合物上的芳香族氨基酸残基还原，生成深蓝色的化合物。在一定的条件下，化合物颜色的深浅取决于蛋白质的浓度。因此可根据其吸光度定量测定测得样品中蛋白质的含量。Folin-酚法广泛应用于水溶性蛋白质含量的测定。Folin-酚法的灵敏度高，比双缩脲法高100倍，肽键显色效果增强减少了因蛋白质种类引起的偏差；适于20～250μg微量蛋白质的测定，可检测的最低蛋白质量达5μg。但存在试剂配制繁琐，且会受到柠檬酸、甘氨酸、Tris 缓冲液、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA 和脲素物质的干扰等一些缺点。