细胞复苏
细胞复苏
一、细胞复苏原理
细胞复苏是与细胞冻存相反的过程，即是细胞恢复生长的过程，是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养。当恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。与细胞冻存的慢冻过程不同，细胞复苏过程升温要快，以防止在解冻过程中细胞内的水分从无定形态重新形成冰晶，影响细胞存活。常规的做法是将细胞从液氮或-70℃冰箱中立即放入37℃水浴中，使其在1-2 min内迅速完成复苏。
二、细胞复苏存活率
细胞最理想的冻存状态，是解冻时能有最大复苏存活率，这就需要尽量将细胞内冰晶的形成减至最少，并减少细胞内水结冰时高浓度电解质浓缩形成所带来的冷冻损伤。这将靠以下条件来实现：
慢速冷冻让水离开细胞，但不能太慢，否则将促进冰晶形成
使用亲水性冷冻保护剂与水结合；
将细胞保存在尽可能最低的温度以减少冰内微团中高盐浓度对蛋白质变性的影响；
快速解冻以减少细胞内剩余冰体融化时冰晶形成和电解质势差的形成。在一些特定情况下，如胚胎和胚胎干（ES）细胞的冻存，则不使用慢速冻存法，而是在液氮中急速冻存，通过形成玻璃化物质（玻璃化保存）而不是缓慢排出水分，以减少冰晶的形成。
三、何时需要复苏细胞
- 当实验需要重新启动细胞培养；
- 细胞传代次数过多（对于常规细胞系，一般50代，原代细胞10代）；
- 培养中的细胞状态变差，出现生长变缓，细胞形态出现异常，出现不规则变形等（如贴壁细胞，出现空泡、拉丝或过多细胞碎片等现象）；
- 因操作或其他原因导致细胞出现污染事故时等。
四、细胞复苏程序
- 所需材料
- 完全培养基，预热至37℃
- Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red
- 台盼蓝溶液
- 血球计数器
- 75%酒精喷壶
- 15ml无菌离心管
- 细胞培养瓶
- 水浴锅
- 细胞复苏操作
（1）生物安全柜（或超净工作台）先进行紫外照射30 min。同时将需要室温回温的培养基从冰箱或储存室中取出放置临时回温区回温。紫外关闭后，开启生物安全柜或超净工作台，正常运行10 min以使柜内气流平稳。用沾有75%酒精的擦拭纸对工作台面进行全面擦拭，包括前面玻璃屏风内侧面。将首先需用到的物品用75%酒精表面擦拭后移入工作台内。
（2）打开水浴锅，设置温度为37℃。一般预留30 min使水浴锅升温至37℃。
（3）根据细胞培养信息表，按对应细胞配制好所需用到的完全培养基。如血清一般保存于－20℃，需提前将血清从－20℃转入4℃，配置完全培养基时确保血清已完全解冻。
（4）查找到需要复苏细胞位置。并跟细胞管理员提前报备。登记复苏细胞薪资
（5）戴上棉手套，先从液氮储存罐中取适量液氮转移入带盖液氮转移盒 中，然后从液氮灌指定位置中取出需复苏的细胞，立即放入液氮转移盒中。
（6）将转移盒转移至水浴锅所在位置，镊子夹出冻存管，用戴棉手套的手捏住冻存管上部，将含冻存细胞悬液的下部迅速没入37℃水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞悬液融解，若冻存管为液相内冻存，为防止复苏时冻存管炸裂，需提前准备一份37℃的无菌水装入带盖盒中，将冻存管放入后立即将盖子盖上，解冻后将水吸干，用75%酒精彻底擦拭表面。
（7）将从水浴锅中或盒中取出的冻存管经75%酒精表面消毒后转移入生物安全柜（或超净工作台）内，用移液枪将细胞悬液转移入15 mL离心管中，然后逐滴加入5 mL完全培养基，此过程耗时1-2 min，然后放入普通离心机中，配平后，室温状态下300g，离心3-5 min。
（8）离心时，取新的T25培养瓶，在培养瓶外表面（培养板板盖或培养瓶侧面）做好标记，标记信息至少包括：细胞名称、代次、每孔/板/皿细胞数、操作人、日期。离心后，用移液器或巴氏吸管去除上清，手指弹拨离心管管壁以分散细胞，再加入5 mL完全培养基重悬细胞，转移入T25培养瓶。。
（9）放回37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
（10）第二天观察细胞复苏后生长状态。对于贴壁细胞，显微镜下明场观察细胞，确认（i）细胞没有污染，（ii）满足90%以上细胞贴壁且细胞外观健康，没有空泡、拉丝或过多细胞碎片等现象，（iii）细胞形态特征符合细胞名称；对于悬浮细胞, 显微镜下明场观察细胞，确认（i）细胞没有污染，（ii）细胞大小均匀，形态均一，无过多细胞碎片等现象，（iii）可取部分细胞进行0.4%台盼蓝染色，计算细胞活率。
（11）确认细胞复苏状态后，放入37℃、5%CO2和95%相对湿度的细胞培养箱中静置培养。
五、细胞复苏注意事项
- 在37℃水浴中迅速将冷冻的细胞解冻（1分钟内）。
- 用预热的生长培养基缓慢稀释解冻的细胞。
- 将解冻的细胞高密度接种，以提高细胞复苏效果。
- 必须采用正确的无菌技术，并且在层流通风棚内进行。
- 必须穿戴个人防护设备，包括面罩或护目镜。储存在液相中的冻存管解冻时有爆炸的危险。
- 有些冻存培养基含有DMSO，DMSO可促进有机分子进入组织。操作含DMSO的试剂时，应采用与此类物质安全危害相适应的设备和操作规范。
参考资料：
- 《细胞培养基本知识手册-GIBCO》
- 《动物细胞培养基本技术和特殊应用指南 第12章 冻存》
