细胞冻存
细胞冻存
一、细胞冻存目的
细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到细胞保种的作用。
二、细胞冻存原理
在低于-70℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。而水在低于零度会结冰，随温度的降低，细胞内外的水分也会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器破坏而引起细胞死亡。同时细胞膜上的脂质分子会受到破坏，使细胞发生渗漏导致复苏时形成溶质损伤。而冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，能减低冰点，减少冰晶的形成达到保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤，如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分在胞内再结晶对细胞造成损伤。
三、细胞冻存程序
1、所需材料
磷酸盐缓冲液，PBS
胎牛血清，FBS
培养基
二甲基亚砜，DMSO
异丙醇
75％酒精喷壶
程序性降温盒
超低温冷冻存储箱
液氮冻存罐
2、冻存液配置
冻存液最好现配现用，使用时确保冻存液温度等于或低于室温。如有一次实验配制后剩余，标记好冻存液配方，配置人、配置时间等信息后，放入4℃冷藏保存，1星期内使用，过期丢弃。
3、操作步骤
（1）观察细胞状态，若细胞状态良好，则继续进行细胞悬液制备；若细胞状态不好，停止操作。 贴壁细胞的汇合程度在80%到刚完全汇合，悬浮细胞密度为1E6/mL到1E7/mL之间。
（2）将细胞培养至对数期晚期。如果是单层贴壁细胞，细胞消化并计数。如果是悬浮细胞，计数并离心。
（3）根据细胞数量，提前准备好冻存管，在管壁上以冻存专用笔写明细胞名称，冻存浓度，冻存体积，操作人员首字母，冻存日期，代次等信息。同时纸质记录表上记录以上信息。
（4）去除离心后的上清，手指弹拨离心管管壁，分散细胞。
（5）用适量体积冻存液重悬细胞，使细胞密度达到5E6/mL至1E8/mL浓度。若细胞总数较少，则最低使细胞密度达到1E6/mL。重悬时使用电动移液器或巴氏吸管，轻轻吹打混匀。
（6）将细胞悬液分装到标记好的冻存管中，拧紧冻存管的盖子使其密封。冻存细胞的分装一般按照1E6每管进行，特殊细胞如分选到的PBMC、MNCs，以1E7每管进行分装。
（7）尽快将冻存管放入室温平衡的降温盒，转移至-80℃冰箱。冻存液中的DMSO在常温状态下对细胞毒性较大，应尽量缩短细胞在常温冻存液中保存的时间。另外，需要确认降温盒内异丙醇反复冻融次数应小于6次，如≥6次，应及时更换新鲜的异丙醇。
（8）细胞冻存人员应在细胞冻存第二天将细胞从冻存盒中移除，置入-80℃冰箱指定位置。
（9）细胞库管理人员应在1个星期内，根据细胞冻存表将需移入液氮保存的细胞放入液氮罐中指定位置，并做好入库记录。冻存细胞从-80℃到液氮罐的转移必须在2分钟内快速完成，冻存管会以约10℃/min的速度升温，如果温度升到-50℃以上，细胞会迅速变质
四、细胞冻存注意事项
1.在高细胞浓度情况下进行培养细胞的冻存，并且细胞传代次数尽可能少。确保冻存前活细胞百分比至少为90%。最佳冻存条件取决于所用细胞系。
2.细胞应缓慢冷冻，可使用可控制降温速度的低温冰箱或者低温冷冻容器，使温度每分钟大约降低1℃。
3.必须使用推荐的冻存培养基。冻存培养基中应含有DMSO或者甘油等冷冻保护剂。
4.将冷冻的细胞于-70℃以下温度储存；温度高于-50℃时，冷冻的细胞将开始变质。
5.必须使用无菌冻存管储存冷冻的细胞。装有冷冻细胞的冻存管可浸于液氮或者在液氮上方的气相空间内保存。
6.必须穿戴个人防护设备。
7.所有与细胞接触的溶液和设备均应为无菌状态。必须采用正确的无菌技术，并且在层流通风橱内进行。
参考资料：
- 《细胞培养基本知识手册-GIBCO》
- 《细胞培养实验指南 第四期期刊》
