利用胶原基质在三维培养中研究乳腺上皮形态发生的方法

 

利用胶原基质在三维培养中研究乳腺上皮形态发生的方法

 

   乳房是一个分支的管状泡状腺体，其导管由上皮细胞形成，基质包含细胞外基质(ECM)、成纤维细胞、免疫细胞、脂肪细胞、血液和淋巴管。一些ECM成分包括I型胶原蛋白、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白和其他大分子。基质-上皮的相互作用在正常和肿瘤性发育过程中介导乳腺器官的形成。为了剖析介导基质-上皮相互作用的机制，三维（3D）模型模型被开发出来。I型胶原蛋白是正常和恶性乳腺中最丰富的ECM成分。乳房造影的密度增加，部分原因是由于I型胶原蛋白的丰度，已被证明会增加女性患乳腺癌的风险。此外，在动物研究中，胶原蛋白密度增加与乳腺癌的发生和发展有关。然而，在三维培养中，胶原蛋白在上皮细胞形态发生中的作用仍有争议。在漂浮的胶原凝胶中培养的小鼠乳腺上皮细胞和肌上皮细胞的原代培养形成了类似于在体内存在的肺泡的结构。人乳腺细胞系T47D和MCF10A在漂浮胶原凝胶中培养时形成腺泡和导管，而在附着凝胶中仅形成未分化的细胞片。相反，人乳腺上皮细胞系HB2在I型胶原蛋白凝胶中只形成了腺泡。然而，当HB2细胞与各种成纤维细胞细胞系或成纤维细胞条件培养基共培养时，就会形成分支管状结构。因此，很明显，形成的上皮结构类型受到各种因素的影响，包括上皮细胞类型，成纤维细胞的存在，以及它们所嵌入的凝胶的生化和物理特性。胶原凝胶也被用于探索局灶粘附激酶途径(FAK)通过机械刺激转导对上皮形态发生的作用。本文介绍利用胶原基质在三维培养中研究乳腺上皮形态发生的方法。

 

方法：

1.按照一般细胞培养方法培养足量的MCF10A细胞和RMF细胞

2.采用胶原3D细胞培养试剂盒（赤萌医疗），按照说明书调配胶原混合液（注意，操作时保持在冰上，以防胶原蛋白形成凝胶），该混合物可按照需要，采用10%FBS的Eagle's MEM进一步稀释至实验用胶原蛋白浓度（0.72 mg/mL）。

3.在共培养中，MCF10A细胞和RMF细胞以3:1的比例进行接种。比如，使用15万个MCF10A细胞和5万个RMF细胞。这个比例与体内上皮细胞和成纤维细胞的数量相匹配。

4.细胞悬浮在1.5 mL胶原蛋白中并接种到12孔板中。

5.胶原蛋白凝胶在37 ℃下凝固30 min，然后在每个孔中加入培养基。

6.凝胶要么是：a)附着在塑料孔上（这些凝胶将被称为附着凝胶），或b) 凝固后立即从孔的侧面和底部分离（浮动凝胶）。

7.培养物维持1-4周，每2-3天更换一次培养基。

 

图 1：含有MCF10A单细胞培养物或MCF10A + RMF共培养物的浮动凝胶整体装片的外围（i）、中间（ii）和中心区域（iii）的上皮形态发生的分析。(A) MCF10A + RMF共培养物：在培养的第4天和第10天，外围区域的上皮结构。箭头指向管状结构；虚线表示凝胶的边缘。(B) MCF10A + RMF共培养物：在培养的第4天和第10天，中间和中心区域的上皮结构。注意管道结构在上层几乎独占的位置。(C) MCF10A + RMF共培养物在培养第1周时的代表图像。连续的图片在通过标准共聚焦显微镜分析获得的z-stack安排。注意从顶部（a）到底部（i）整个凝胶层的上皮形态的差异。(D) MCF10A单细胞培养物：在培养的第4天和第10天，中间和中心区域的上皮结构。注意管道结构在上层几乎独占的位置。(E) MCF10A单细胞培养物中上皮细胞形态发生的时间过程。

 

参考文献

 Biomaterials  . 2010 May;31(13):3622-30.