肿瘤细胞球状体作为评估药物和药物设备组合的生物模拟三维癌症模型

 

肿瘤细胞球状体作为评估药物和药物设备组合的生物模拟三维癌症模型

 

  细胞的多细胞聚集体，称为球状体（spheroids），对研究肿瘤行为和评估药理活性药物的反应很有意义。与经典的二维单层相比，球状体更真实地再现了在体内发现的肿瘤宏观结构。越来越多的证据显示，三维系统比其二维（2D）系统更能促进体内的细胞行为，因为它重现了本地肿瘤环境的更多特征，因此三维（3D）体外肿瘤细胞球状体（spheroids）培养模型正被作为研究肿瘤行为和药物反应的临床前工具。这些模型被证明比基于单层的系统更具预测性。

 

  这些三维肿瘤细胞模型大多是通过以下方式制备的。(a) 在非粘附表面或悬浮液中生长细胞，以诱导细胞集群；(b) 在预先形成的聚 合物支架中播种细胞；或(c) 将细胞嵌入水凝胶中，以促进细胞集群的形成以及细胞基质的附着。形成的肿瘤细胞球状体还是需要种入与其胞外基质相似的环境进行后继培养。本文介绍以（a）非粘附表面生长细胞以诱导细胞集群的方法形成肿瘤细胞球状体的方法，以及将球状体嵌入胶原蛋白凝胶培养的方法。

 

方法

人类骨肉瘤和乳腺癌多细胞球体的形成以及嵌入胶原蛋白基质的过程

图1.嵌入球状体的形成：通过将细胞（红色）在培养基（粉红色）中的悬浮液放在琼脂糖（黄色） 涂层的孔中，促进球状体的形成。72小时后，形成球状体，然后转移到胶原蛋白凝胶中。

 

A.细胞培养

1.选取合适肿瘤细胞系。实验采用小儿骨肉瘤细胞系U2OS和乳腺癌细胞系MDA-MB-231（ATCC，Manassas，VA）。这两个细胞系都表达高水平的钙黏蛋白，容易形成球状体，并且具有良好的特征，包括它们的蛋白质表达和分泌特征，以及在癌症研究应用中被广泛研究 。

2.细胞在完整的RPMI（U2OS）或 DMEM（MDA-MB-231）培养基中培养，辅以10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液。细胞培养物以二维单层形式保存在37℃、5%CO2培养箱中。

 

B.球状体的形成

细胞聚集是通过在涂有琼脂糖的96孔板中生长细胞悬浮液来诱导的。

1.将 0.15g 琼脂糖（ SigmaeAldrich, St. Louis, MO）与10mL PBS混合制成1.5%（重量/体积）的琼脂糖溶液。

2.该溶液被微动摇，直到琼脂糖溶解 ，在孔中涂布过程中保持在一个热板上，以防止过早凝胶化。

3.准备96孔板，将70uL的热琼脂糖溶液移入每个孔中，并冷却20分钟。

4.通过胰蛋白酶化消化，将细胞单层从其培养瓶中分离出来。

5.对细胞进行计数，并将其重新悬浮。

6.将100uL的细胞悬液加入到琼脂糖涂层的孔中。

7.72小时后 ，通过轻柔的移液将产生的细胞聚集体（spheroids）取出，并立即播种到胶原蛋白凝胶中，如下所述。

 

C.胶原蛋白包埋

1.采用高浓度牛I型胶原蛋白（胶原3D细胞培养试剂盒，赤萌医疗），用5×PBS替换5×DMEM培养基后，按照说明书调配胶原混合液（注意，操作时保持在冰上，以防胶原蛋白形成凝胶），该混合物可按照需要，采用PBS进一步稀释至实验用胶原蛋白浓度（2-4 mg/mL）。

2.肿瘤细胞球状体被添加到96孔板的每个孔中的100 uL未聚合的胶原蛋白溶液中。

3.1小时后，在凝胶上加入100uL培养基或含有药物的培养基。

4.每隔24小时取出并更换这种培养基。胶原蛋白包埋后，在实验期间每24小时对球状体进行一次成像检查。

 

参考文献

1.Biomaterials  . 2014 Feb;35(7):2264-71.