用于癌症和抗癌药物建模的三维胶原支架中肿瘤细胞系癌症干细胞特性的增强

 

用于癌症和抗癌药物建模的三维胶原支架中肿瘤细胞系癌症干细胞特性的增强

传统的二维(2D)细胞培养系统是体外研究癌细胞的一种方便方法,但它不能模拟肿瘤结构,如细胞间的交流和细胞与细胞外基质(ECM)的相互作用,而这些在癌细胞中起着关键作用。在二维培养的细胞被迫采用片状形态,并改变细胞的生长、迁移和凋亡。同时,在癌细胞单层培养中,对细胞增殖和基因表达至关重要的ECM的沉积减少。当细胞从体内条件转移到二维细胞培养板时,癌细胞的恶性表型也急剧减少。 因此,药物的作用细胞间的相互作用、上皮向间质转化(EMT)和癌症干细胞(CSCs)的功能被削弱。这些发现表明,二维培养的癌细胞不能很好地代表它们在体内的生理条件。

体外 2D 细胞培养系统与体内肿瘤之间的差距通过体外三维 (3D) 细胞培养系统弥合。这些三维肿瘤细胞模型大多是通过以下方式制备的。(a) 在非粘附表面或悬浮液中生长细胞,以诱导细胞集群;(b) 在预先形成的聚合物支架中播种细胞;或(c) 将细胞嵌入水凝胶中,以促进细胞集群的形成以及细胞基质的附着。形成的肿瘤细胞球状体还是需要种入与其胞外基质相似的环境进行后继培养。本文介绍以(b) 在预先形成的聚合物支架中播种细胞的方法形成肿瘤细胞球状体的方法。

许多基质材料和合成聚合物被用于开发 3D 细胞培养支架。胶原蛋白是 ECM 的主要成分,可以为细胞粘附和迁移提供适当的表面。由于其优异的特性,包括生物相容性、机械强度、降解性和有限的免疫原性,它已被广泛用于培养细胞。对于 3D 癌细胞培养系统,大多数研究都集中在胶原蛋白水凝胶上。

 

方法:

三维胶原蛋白支架的制备

胶原支架由高浓度牛I型胶原蛋白制成(胶原3D细胞培养试剂盒,赤萌医疗)。

1. 将溶液用4M NaOH进行中和;

2.. 将均匀溶液在去离子水中透析5天并冻干;

3.. 将得到的多孔胶原蛋白支架切成0.1 *0.5 *0.5 cm 的小球,并和1 mg/ml 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、0.6 mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行交联;

5. 交联后,微球再次冻干,Co 60 灭菌,4℃保存备用。

 

细胞培养

1.在 37°C 和 5% CO2 条件下,将细胞培养在含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中;

2.在室温 (RT) 下,将胶原蛋白浸泡在含有 50% FBS的DMEM 中0.5小时;

3.将胶原蛋白颗粒加入细胞悬液并在37℃下保持1小时。;

4.加入含 10% FBS 的DMEM以浸没所有细胞接种的微球24小时;

5.将支架和接种的细胞一起转移到摇床上的30 cm 细胞培养板上,每天更换细胞培养基。

 

细胞形态学分析

通过扫描电子显微镜(SEM,S-3000N;Hitachi,Tokyo,Japan)和共聚焦分析显示接种在 3D 胶原支架中的细胞形态。

1.样品用预冷的D-PBS洗涤3次,用预冷的卡诺夫斯基固定液于4℃下固定8小时;

2.在一系列乙醇(50%、75%、 85%、95%、100% 和 100%)中对细胞进行脱水;

3.样品经临界点干燥后,在 SEM 成像之前用金箔溅射涂层;

4.将带有细胞的 3D 胶原支架浸入 FDA 溶液中2分钟,用D-PBS洗涤两次后通过共聚焦显微镜(Leica TCS SP5,德国)观察;

5.标本用10%福尔马林溶液固定,石蜡包后以4mm切片,用苏木精和伊红 (H&E) 染色进行形态学分析。

 

细胞增殖检测

在2D细胞培养板和3D胶原蛋白支架中的细胞增殖使用血细胞仪进行检测。

1.将0.1%的胶原蛋白酶I和0.2%的分散酶II溶液加入到二维细胞培养板和三维支架中,在37摄氏度下培养1.5小时;

2.用D-PBS洗涤细胞悬液两次,并在1000rpm下离心;

3.用0.25%的胰蛋白酶消化2分钟,并重新悬浮在含有10%FBS的DMEM中,在特殊时间点用血球仪计算细胞数。

 

在多孔胶原支架中培养的MCF-7细胞通过SEM分析、共聚焦成像、H. E. 染色观察,在二维细胞培养板中接种的MCF-7细胞表现出片状的三角或多边形形态(图1a),而在三维胶原蛋白支架中的细胞则表现出多样化的形态(图1b)。三维的细胞显示出圆形、梭形和散开的外观(图1c)。三维胶原蛋白支架被细胞填满,形成了一个多层细胞结构(图1d)。

图1.在不同条件下培养的MCF-7细胞的形态学图像

(a) 在二维培养的细胞显示出片状的三棱形或多角形的形态,比例尺为50毫米。

(b) SEM和(c)共聚焦图像显示了三维胶原蛋白支架中细胞的多样化形态,比例尺为50毫米。

(d) 用细胞培养的三维胶原蛋白支架的横截面的H.E.染色显示了多层细胞结构,比例尺为50毫米。

 

参考文献

Biomaterials  . 2012 Feb;33(5):1437-44.

 

 

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