利用胶原蛋白凝胶进行三维培养模拟大鼠睾丸细胞体外生精过程
利用胶原蛋白凝胶进行三维培养模拟大鼠睾丸细胞体外生精过程
精子生成是一个漫长而复杂的过程，发生在睾丸的精管中。它由发育中的生殖细胞和周围环境之间的多种相互作用调节。在生精小管内，生殖细胞与体细胞，如Sertoli细胞和myoid细胞直接接触。此外，由Leydig细胞产生的雄性激素在很大程度上控制着睾丸中生殖细胞的发育。在曲细精管内，Sertoli细胞和早期生殖细胞（如精原细胞和早期精母细胞）与基底膜直接接触。基底膜（细胞外基质的一种）对于表达几种类型的整合素的精 索上皮细胞的生存、分化和重塑非常重要。此外，从基底膜到生殖细胞的由外而内的信号传递可以通过Sertoli细胞间接表现出来，Sertoli细胞包围生殖细胞，从而调节生殖细胞的发育。因此，为了模仿精索上皮内的局部环境，较为逻辑的思路是选择一种允许基底膜、生殖细胞和Sertoli细胞之间相互作用的体外精子生成培养系统。
使用胶原模仿基底膜，用于体外精子生成的培养系统有以下好处：
1.胶原凝胶中培养的睾丸细胞分化精子能力更强，与成年睾丸的细胞分化更像。
2.睾丸细胞在胶原凝胶中进行三维培养的细胞活力高于二维培养。
3.胶原凝胶为睾丸中的Sertoli细胞和生殖细胞提供三维的整合素结合位点，帮助这两种细胞的生存和分化。
4.胶原凝胶中可以支持Leydig细胞的存活，同时Leydig细胞还具有功能，可以在进行三维培养的时候与睾丸细胞进行复杂的旁分泌互动，帮助精子生成。
方法：
A.睾丸细胞获得
1.将去势的睾丸放在一个塑料培养皿中，并切成小碎片。
2.将碎片置于含有2毫克/毫升胶原酶（I型），1毫克/毫升透明质酸酶、10毫克/毫升DNaseI，1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂的溶液中，32C孵育30分钟。
3.将分离的睾丸细胞以1500rpm离心10分钟，以含有10%牛犊血清的DMEM/F12培养基中洗涤两次。
4.用睾丸细胞培养基本培养基调整细胞浓度为1.2E7个细胞/毫升。 基本培养基配方为DMEM/ F12，10 mg/ml胰岛素-转铁蛋白-硒溶液，10-4 M维生素C，10 mg/ml维生素E，3.3 x 10-7M维甲酸，3.3x10-7 M视黄醇，1 mM丙酮酸,100 mIU重组卵泡刺激素，10-7M睾酮,10%抗生素-抗霉菌溶液和10%胎牛血清。
睾丸细胞的胶原基质培养
1.将胶原3D细胞培养试剂盒（赤萌医疗）中胶原原液用细胞培养用水稀释至2mg/mL。
2.将2ML胶原蛋白溶液（2mg/mL）与0.4 mL FBS，0.8 mL 3X DMEM/F12培养基混匀，然后与0.8mL 睾丸细胞悬液混合。
3.将混合物倒入60毫米的细菌培养皿中，防止胶原蛋白凝胶基质和睾丸细胞黏着在培养皿上。
4.轻轻搅拌1分钟，让凝胶形成，然后加入培养基覆盖凝胶。
5.将放置在培养皿上的凝胶在32C、95%的空气和5%的二氧化碳中2轻轻摇动（45 rpm/min），培养9或22天。
6.培养液隔天更换。
7.22天后，通过胶原酶（I型，0.1毫克/毫升）处理重新溶解胶原凝胶以释放凝胶中的细胞用于下游分析。
参考文献图1.睾丸细胞在胶原蛋白凝胶中培养的第22天的HE染色。胶基质中形成的囊状结构（a的箭头；c的星号）
Biomaterials 27 (2006) 2845-2853
