利用胶原蛋白凝胶进行三维培养模拟大鼠睾丸细胞体外生精过程

 

利用胶原蛋白凝胶进行三维培养模拟大鼠睾丸细胞体外生精过程

  精子生成是一个漫长而复杂的过程,发生在睾丸的精管中。它由发育中的生殖细胞和周围环境之间的多种相互作用调节。在生精小管内,生殖细胞与体细胞,如Sertoli细胞和myoid细胞直接接触。此外,由Leydig细胞产生的雄性激素在很大程度上控制着睾丸中生殖细胞的发育。在曲细精管内,Sertoli细胞和早期生殖细胞(如精原细胞和早期精母细胞)与基底膜直接接触。基底膜(细胞外基质的一种)对于表达几种类型的整合素的精 索上皮细胞的生存、分化和重塑非常重要。此外,从基底膜到生殖细胞的由外而内的信号传递可以通过Sertoli细胞间接表现出来,Sertoli细胞包围生殖细胞,从而调节生殖细胞的发育。因此,为了模仿精索上皮内的局部环境,较为逻辑的思路是选择一种允许基底膜、生殖细胞和Sertoli细胞之间相互作用的体外精子生成培养系统。

 

使用胶原模仿基底膜,用于体外精子生成的培养系统有以下好处:

1.胶原凝胶中培养的睾丸细胞分化精子能力更强,与成年睾丸的细胞分化更像。

2.睾丸细胞在胶原凝胶中进行三维培养的细胞活力高于二维培养。

3.胶原凝胶为睾丸中的Sertoli细胞和生殖细胞提供三维的整合素结合位点,帮助这两种细胞的生存和分化。

4.胶原凝胶中可以支持Leydig细胞的存活,同时Leydig细胞还具有功能,可以在进行三维培养的时候与睾丸细胞进行复杂的旁分泌互动,帮助精子生成。

 

方法:

A.睾丸细胞获得

1.将去势的睾丸放在一个塑料培养皿中,并切成小碎片。

2.将碎片置于含有2毫克/毫升胶原酶(I型),1毫克/毫升明质酸10毫克/毫升DNaseI,1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂的溶液中,32C孵育30分钟。

3.将分离的睾丸细胞以1500rpm离心10分钟,以含有10%牛犊血清DMEM/F12培养基中洗涤两次。  

4.用睾丸细胞培养基本培养基调整细胞浓度为1.2E7个细胞/毫升。 基本基配方为DMEM/ F1210 mg/ml胰岛素-铁蛋白-硒溶液,10-4 M维生C,1mg/ml生素E,3.3 x 10-7M酸,3.3x10-7  M视黄醇,1 mM丙酮酸,100 mIU重组卵泡刺激素10-7M睾酮,10%抗生-抗霉菌溶液和10%胎牛血清。

 

睾丸细胞的胶原基质培养

1.将胶原3D细胞培养试剂盒(赤萌医疗)中胶原原液用细胞培养用水稀释至2mg/mL。

2.将2ML胶原蛋白溶液(2mg/mL)与0.4 mL FBS,0.8 mL 3X DMEM/F12培养基混匀,然后与0.8mL 睾丸细胞悬液混合。

3.将混合物倒入60毫米的细菌培养皿中,防止胶原蛋白凝胶基质和睾丸细胞黏着在培养皿上。

4.轻轻搅拌1分钟,让凝胶形成,然后加入培养基覆盖凝胶。

5.将放置在培养皿上的凝胶在32C、95%的空气和5%的二氧化碳中2轻轻摇动(45 rpm/min),培养9或22天。

6.培养液隔天更换。

7.22天后,通过胶原酶(I型,0.1毫克/毫升)处理重新溶解胶原凝胶以释放凝胶中的细胞用于下游分析。

 

参考文献图1.睾丸细胞在胶原蛋白凝胶中培养的第22天的HE染色。胶基质中形成的囊状结构(a的箭头;c的星号)

 

Biomaterials 27 (2006) 2845-2853

知识分享

用专业的技术资料,解决您的科研问题